Мадона е третото от общо шест деца в семейството на Силвио П. Чиконе — Тони, който е син на италиански eмигранти, и Мадона Луиз Фортин, която е с френско-канадски корени. По-късно певицата се отъждествява като „италиано-американка“, т.е. американски гражданин от италиански произход. Израства в католическа атмосфера.

Майка ѝ умира на 31-годишна възраст от рак на гърдата на 1 декември 1963 г., когато малката Мадона е на 5 години. Певицата често споменава влиянието, което оказва смъртта на майка ѝ оказва върху кариерата ѝ и върху нея самата. След смъртта на съпругата си Чиконе наема камериерка, за която по-късно се жени. Двамата имат две деца.

Бащата държи всичките му деца да ходят на уроци по музика. След като прекарва няколко месеца в изучаване на пианото, Мадона успява да убеди баща си да замени тези уроци с курсове по балет.

Мадона учи в гимназията Рочестър Адамс, където е пълна отличничка и членува в мажоретния състав. След като завършва, тя постъпва в Мичиганския университет, където получава стипендия заради постиженията си в танците.
Под въздействието на своя учител по танци (Кристофър Флин), Мадона изоставя следването и само след един семестър се премества в Ню Йорк, за да търси успех като танцьорка. Учи модерни танци при легендата Марта Греъм.
След като през 1979 участва като танцьорка в световното турне на френската диско звезда Патрик Ернандес, Мадона решава да изостави танците и се насочва към правенето на музика. Сформира няколко групи, сред които „Брекфъст Клъб“ (Breakfast Club) и „Еми“ (Emmy). Пише сама няколко песни, чрез които става известна в няколко местни нюйоркски клуба.